已经有一些工具可以根据已有测序数据推断测序文库的链特异性，比如 RseQC 。RseQC 从 FASTQ 文件中抽取少量的 reads 比对到参考基因组上，从而推断测序文库的链特异性。另外，你也可以自己抽取少量的 reads 然后使用不同的参数直接运行 HISAT2 比对，然后使用 HTSeq 计算 counts ，这样就能直接比较了。

1 分子生物学概念

1.1 正链（forword strand）与反链（reverse strand）

这组概念是相对的，它们指互补的两条核算链，至于谁是正链，谁是反链，人为决定。但就一个给定的参考基因组而言，研究者给出的那个链就是所谓的正链（forword），另一条链是反链（reverse）。

1.2 正义链（sense strand）与反义链（antisense strand）

两条互补的 DNA 链，其中一条携带编码蛋白质信息的链称为正义链，另一条与之互补的称为反义链。回顾一下中心法则，我们就可以发现，所谓 “编码蛋白质信息” 即指 RNA 的编码区，也就是说 RNA 编码区的序列与 DNA 正义链编码区的序列是一致的。因此，正义链的信息与 RNA 链的信息是等价的。在 RNA 转录过程中，DNA 反义链作为模板指导 RNA 合成。

在本文中，我们做一个约定：我们知道用于 RNA-Seq 的 mRNA 都是单链，而且包含蛋白质编码信息。那么以 mRNA 模板反转录出的第一链 cDNA 就可以称之为反义链，因此本文会把第一链 cDNA 和反义链混着用，你们需要记住两者是指同一个意思。相对的，第二链 cDNA 可以称之为正义链，因为它的序列与 mRNA 相同，包含着蛋白质编码信息。

1.3 正链基因与反链基因

这两个概念仅用于本片文章。正链基因是指 RNA 转录方向与正链方向相同的基因，即基因的正义链与基因组的正链相同。反链基因是指 RNA 转录方向与反链相同的基因，即基因的正义链与基因组反链相同。

2 Illumina 建库与测序原理

2.1 测序接头的功能

测序接头的本质是一段短的碱基序列，基本包括三个部分：

  1. 与 flow-cell 上面寡核苷酸相同或互补的片段 P5 和 P7 ；

  2. 测序时测序引物结合部分 Rd1 SP 和 Rd2 SP ；

  3. 用于区分不同样本的 Index ；

接头是待测DNA片段与Flow-cell连接的桥梁，目的片段连接接头后可以在flow cell上扩增再测序。

2.2 TA 克隆法添加测序接头

TA克隆加接头建库的方法是目前应用最广泛的建库技术，简单描述就是：将提取好的DNA片段化或者反转录的 cDNA，进行末端修复和加A尾，然后连接上接头（adapter），最后通过PCR扩增（可选），中间再穿插着纯化/分选步骤就完成了文库的构建。在这里，提前合成好的带T尾接头和末端带A的目的片段在DNA连接酶的作用下通过TA克隆方式连接（图1）。

图1

从原理图我们可以发现，RNA 反转录后的 cDNA ，正义链和反义链都被加上接头进入测序仪了。但问题在于，为什么 “Only two of four species go to the sequencer” ？

Illumina TrueSeq 文库制备流程如下：

  1. 捕获带有 polyA 的 mRNA 并片段化。
  2. 合成第一链 cDNA，即合成反义链。
  3. 合成第二链 cDNA，即合成正义链。如果需要连特异性建库，那么会在这一步用 dUTP 代替 dTTP 。
  4. 在双链 cDNA 的 3’ 端添加一个碱基 A 。
  5. 在 cDNA 两端加上接头。接头的种类有单端 index、双端 index 以及无 index 的通用接头。
  6. 富集 DNA 片段。在此步，如果使用了 dUTP，那么含有 U 的链（第二链 cDNA）的聚合酶链式反应就会终止。
  7. 最终的文库，P5 接头在 5’ 端，P7 接头在 3’ 端。一条双链 cDNA 的方向由其正义链或者反义链的方向决定。对 dUTP 建库来说，P5 在反义链的 5’ 端。

2.3 dUTP 链特异性建库

在非连特异性建库的 “富集 DNA 片段” 这一步中，如果没有使用 dUTP 终止第二链 cDNA 的聚合酶链式反应，那么扩增富集后带有测序接头的双链 cDNA 有两种类型：来源于第一链 cDNA 的 ds cDNA，以及来源于第二链 cDNA 的 ds cDNA 。这两种类型的 ds cDNA 混在一起，导致我们无法区分测序结果

与常规的 TA 克隆加接头建库的方法相比，dUTP 链特异性建库会导致反转录的 cDNA 其中正义链降解掉了。也就是说，最后的 insert DNA fragment 都来自第一条合成的 cDNA （first-strand cDNA），即反义链。因此，这种类型叫做 fr-firststrand 。

图2

我们从图二开始理解这个过程。红色的接头是 P5 ，read 1 从这里开始测序；蓝色的接头是 P7，read 2 从这里开始测序。从第 7 步 “dUTP strand degradation” 我们可以了解到，只有 RNA 反转录的第一链 cDNA （即反义链） 保留下来了。在加上 barcode 之后，上级测序。因为红色的 P5 接头上有 Rd1 sp ，因此我们可以知道 read 1 序列与 first-strand cDNA 序列已知，也就是说 read 1 是反义链。

2.4 Paired reads 的方向性

为什么说 Paired reads 具有方向性

Read 1 序列能够比对到反义链。

Read_1

Read 2 序列能够比对到正义链。

Read_2

测序文库的分类

根据链特异性建库方式的不同，测序文库可以分为下图中的三类。

library-type-pic1

图中，“fr” 的含义是 fragment ，即 insert DNA fragment 。“firststrand” 和 “secondstrand” 很好理解，这个 DNA 片段来着第一链 cDNA 还是第二链 cDNA 。“/1” 和 “/2” 的分别代表着 read 1 和 read 2 ，

那么，测序文库类型就可以分成：

  1. “fr-firststrand”：insert DNA fragment 来自第一链 cDNA ；比如 dUTP 链特异性建库。

    这种建库类型，read 1 能够比对到反义链，read 2 能够比对到正义链。在 IGV 中，比对到正链基因的 read pair 方向性应该是 R1F2 或者 R2F1 ，比对到反链基因的 read pair 方向性 F1R2 或者 R2F1 。

  2. “fr-secondstrand”：insert DNA fragment 来自第二链 cDNA；比如标准的 SOLiD 建库法。

    这种建库类型，read 1 能够比对到反义链，read 2 能够比对到正义链。

  3. “fr-unstranded”：无法区分 insert DNA fragment，即非链特异性建库；比如标准的 Illumina 建库法。

3 用 IGV 判断测序文库的链特异性

3.1 以正链和负链的方向来决定 reads 颜色

IGV 中 bam 文件所在的 track 可以给每条 reads 指定不同颜色，因此我们可以利用 “Color aligments by read strand” 设置将 reads 分成粉红和淡蓝两种颜色。

  • 所有与正链方向相同的 reads 被标记为粉红色。
  • 所有与负链方向相同的 reads 被标记为淡蓝色。
  • 灰色的 reads 未配对的或者另一条 read 未比对上的 reads 。

3.2 以 Pair orientation 来决定 reads 颜色

给定一个 read pair ，如果 read 1 与正链方向相同（即 read 1 = forward read），我们将它标记为 F1，这个记号可以理解为 “Forward read is first read”。确定 read 1 的记号为 F1 后，这个给定 read pair 中的 read 2 方向必然与反链方向相同（即 read 2 = reverse read），我们将它标记为 R2，可以理解为 “Reverse read is second read”。这样，我们就知道这个给定 read pair 的 pair orientation 就是 “F1R2” 或者 “R2F1” 。两种表示方法的含义相同，区别在于你查看的对象是 read 1 还是 read 2。

给定一个 read pair，如果 read 1 与负链方向相同，我们将它标记为 R1 。确定 read 1 记号后，read 2 的记号就可以确定为 F2。那么这个给定 read pair 的 pair orientation 就是 “R1F2” 或者 “F2R1” 。

实际上 Pair orientatin 就代表着这个 read pair 是从哪条链合成出来的。

3.3 dUTP 链特异性建库的特征

正链基因：Read 1 与 mRNA 正义链相同，Read 2 与反义链相同。所以，正链基因是 F1R2 或者 R2F1

反链基因：F2R1 或者 R1F2

4 一个复杂的示例：aRNA-Seq

aRNA 是 anti-RNA ，是 mRNA 的反义链。

如果我们使用体外转录的手段扩增微量 mRNA ，那么我们最终拿到的产物的 aRNA，即反义 RNA (anti-RNA) 。那么，我们使用 dUTP 链特异性建库时，第一链 cDNA 实际上是正义链，这正好与普通 mRNA dUTP 建库相反。也就是说，aRNA-Seq 使用 dUTP 的方法获得的测序文库，真正的链特异性是 “fr-secondstrand” 。

Reverse_Strand_Gene

Forward_Strand_Gene

通过上面两图我们可以发现，比对到正链基因的 read pair 的方向性是 F1R2，比对到负链基因的 read pair 的方向性是 F2R1 。这个特征与 “fr-secondstrand” 文库类型匹配。

参考资料

  1. Directional RNA-seq data -which parameters to choose? https://chipster.csc.fi/manual/library-type-summary.html